t-BLM应用实例三｜抗菌肽模拟物与真菌毒素的膜作用机制研究

2026-05-15 13:31

在前两篇应用实例中，我们介绍了 t-BLM（tethered bilayer lipid membrane，栓系磷酸双酯膜）技术在外泌体膜融合、磷脂酶活性检测、癌症标志物相互作用及细胞屏障特性分析中的应用。本篇继续聚焦膜相关研究中的另一类重要问题：抗菌分子和病原毒素如何作用于脂质膜。

抗菌肽模拟物的研发，关注的是如何选择性扰动细菌膜以实现抗感染作用；真菌毒素机制研究，则关注病原体如何通过破坏宿主上皮膜促进感染和免疫激活。这两类问题都需要直接观察脂质双层膜的通透性和完整性变化，因此非常适合使用 t-BLM/tethaPOD 平台进行机制分析。

一、短链两亲性阳离子肽模拟物的抗菌机制研究

Kuppusamy R et al. Design and synthesis of short amphiphilic cationic peptidomimetics based on biphenyl backbone as antibacterial agents. European Journal of Medicinal Chemistry, 2018, 143: 1702–1722

抗菌肽及其合成模拟物近年来受到广泛关注，是因为它们通常不依赖传统抗生素的单一蛋白靶点，而是通过与细菌膜相互作用，引起膜去极化、通透性增加或膜结构扰动，从而发挥抗菌作用。

图1.基于联苯骨架的短链两亲性阳离子肽模拟物设计及代表性化合物 “25g” 对细菌膜的影响

本研究设计并合成了一系列基于联苯骨架的短链两亲性阳离子肽模拟物。作者通过调整分子中的疏水基团和阳离子基团，构建出一组结构相近但疏水性、电荷特征不同的候选化合物（图1A），并系统评价其抗菌活性和细胞毒性。

在这些候选分子中，编号为 “25g” 的化合物表现最突出。这里的 “25g” 并不是通用药物名称，而是论文中对候选化合物的结构编号。该化合物对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌均表现出较好的抑菌活性（图1B、C），同时对人体细胞的毒性相对较低。因此，作者将 “25g” 作为代表性活性分子，进一步开展膜作用机制研究。机制实验显示，“25g” 可引起细菌细胞质膜去极化，提示其抗菌作用与细菌膜功能受损密切相关。为了进一步验证其是否直接影响脂质双层膜，作者采用 t-BLM 技术结合交流阻抗谱，检测不同活性化合物对脂质膜的作用。

图2. 不同抗菌化合物在 10 μM 浓度下引起的 tBLM 电导变化

实验结果显示，“25g” 相关活性化合物能够引起膜电导的变化（图2）。其中，膜电导升高提示脂质双层通透性增加。值得注意的是，这种变化并不符合典型离子通道形成的特征，更可能反映了抗菌肽模拟物对膜的扰动、变薄或局部通透化作用。

传统抗菌活性评价常用 MIC（最低抑菌浓度），即抑制细菌可见生长所需的最低药物浓度。MIC 可以回答“这个分子是否有效”，但很难说明“它如何起效”。而 t-BLM/tethaPOD 平台能够进一步判断候选分子是否直接作用于脂质膜、是否改变膜通透性，以及其膜作用强弱是否与分子结构相关。因此，在抗菌肽模拟物研发中，t-BLM/tethaPOD 平台的价值不只是补充一个检测结果，而是把抗菌分子的评价从单纯活性筛选推进到膜作用机制解析。这类膜电学数据可用于早期识别具有膜活性的候选分子，并为后续结构优化提供更清晰的依据。

二、Candidalysin：真菌肽毒素如何破坏上皮膜并激活免疫

Moyes DL et al. Candidalysin is a fungal peptide toxin critical for mucosal infection.
Nature, 2016, 532(7597): 64–68

白色念珠菌（Candida albicans）是常见的机会性致病真菌，在黏膜感染过程中可由酵母型转变为侵袭性菌丝型。该研究首次鉴定出一种由白色念珠菌分泌的溶细胞肽毒素，并将其命名为 Candidalysin。Candidalysin 来源于菌丝相关分泌蛋白 Ece1p，经加工后形成具有毒素活性的 Ece1-III 肽段。研究发现，缺失该毒素的白色念珠菌虽然仍可形成菌丝并侵入上皮，但不能有效损伤上皮细胞，也不能充分激活 p-MKP1/c-Fos 危险信号通路和炎症因子释放，在黏膜感染动物模型中的致病性显著下降。也就是说，Candidalysin 是白色念珠菌造成黏膜损伤和诱导免疫反应的关键毒力因子。

从作用机制看，Candidalysin 能够直接作用于脂质膜并引起膜通透化。作者通过脂质体 FRET、人工膜阻抗谱、平面脂质膜和上皮细胞电生理实验，证明该肽可扰动膜结构，使膜电导增加，并在上皮细胞中诱发内向电流和钙离子内流。

在膜阻抗谱实验中，作者直接使用了 t-BLM/tethaPOD 平台。实验采用含有 10% tethering lipids 和 90% spacer lipids 的 t-BLM T10 slides 构建栓系脂质双层膜。加入不同浓度的 Ece1-III 肽段前，先连续检测膜电导和膜电容以获得稳定基线，随后注入肽段并实时监测膜电学参数变化，信号由 tethaPOD 读取（图3）。